文献天天读 – 2011Apr24 – 0005

不是每经历一件事，都会留下难以磨灭的印象。往往危机累积到一定程度爆发，惨痛教训复现后慢慢找到出路，因此年轻时一夜长大，上了年纪要小心一夜白发。

其实对文献信息的挖掘也该是多角度多层次的，这体现在要读懂文献的图和文字，要找到同一批作者的思路，不同组实验现象背后的本质；最困难的是要温故知新，融会贯通，每多读一次都能理解更深刻，极具挑战本人不想思考的天性。

在我开始了解纳米孔测序的时候，相关领域已经建立了很多理论，人们逐渐了解到大部分时刻大部分空间中DNA是在如何运动的，在构建的强电场受限区域中，DNA又将受到如何的作用电泳和拉伸。当这一理论深深印在一片空白的大脑的时候，我便会想知道，这写是不是这个物理过程的全部，还有没有盲点和坏点。这篇文章没有采用DNA这种类似polymer属性的物质（害得我借来高分子物理预读之），而是才用更为简单的蛋白颗粒avidin（大概直径5-8nm吧）来研究物质和纳米孔的相互作用，是对大理论框架核心部分的侧面例证。

从经典静电场的角度来想，同号相斥，异号相吸。外电场作用下，两种带电表面相对运动自然而言会因为带电荷量（体积不变时就是表面电荷密度）的不同，产生不同的实验现象。这里带电蛋白颗粒的电场运动称之为电泳，而纳米孔表面固定电荷产生的反方向相对运动称之为电渗，两者方向相反。类似于分析化学中的滴定实验，DNA或者带电蛋白在溶液中都有一个等电点的概念，即在一定条件下可以实现静电荷为零。我们调节pH既可以改变蛋白的表面电荷，同时又可以改变纳米孔的表面电荷。根据单独测定带电量的结果，我们可以预计有几种情况：正正、正正（相抵消）、正负、负负，这意味着同号会产生排斥作用，能量势垒势必增加（这个可能还不可以直接测量），异号相吸会促进过孔过程的发生，而相抵消的时刻会是扩散作用占据优势的时候。

结果如图所示，pH=6告诉我们相吸会比相斥更容易发生过孔事件，这符合常理；而pH=4在不同方向电场上均可以看到过孔信号，尽管常识告诉我们电场越大电泳一般越剧烈，但事实并非如此，指南针也有失灵的时候！如果某些实验中我们观测不到现象不一定是仪器坏了，而是纳米孔表面带电是件非常重要的事，就像卢广仲说要吃早餐一样！

评：尽管人们都在说DNA和纳米孔的相互作用，那到底是怎么作用的呢？从流体上来说水没有动，电场的作用是不同迁移率的带电离子或牵或拉着同样带电的DNA移动表现出来；从静电方面，纳米孔上的多余电荷会排斥或吸引，直接影响DNA的运动过程。相比DNA实验结果的复杂，我相信他们肯定尝试了，只是结果不如avidin的好，不如particle的模型更清晰。只是我不清楚电渗力与表面电荷密度、不同电场强度、不同离子强度之间的纠结关系，有待深究。

静电是可怕的，也因此造就了EDS领域，IC工艺中需要避免各种表面电荷、悬挂键的产生、PCB设计和制造中也需要避免静电伤害；而静电也有很多效应可以加以利用，比如近期热门的Ion Concentration Polarization（ICP），阴/阳离子可以选择性通过纳米沟道，未来可以应用于海水脱盐，而在本领域今年也有人成功变异生物孔内氨基酸序列，改变电荷量和电荷符号，着实取得了很好的减速效果。

换个角度思考，表面电荷可以显著改变整个事件的发生与否。当我们掌握得当，可以部分提高或者减弱相互作用，使得DNA过孔变得更“纠结”或者“干脆”。

文献天天读 – 2011Apr22 – 0004

常说事不过三，到了第四篇出现瓶颈鸟。刚写的时候因为手头正好有总结完的热腾腾的slide，码码文字就是一天。现在一下子要重新做一批，工作量就上来了。今天和小老板聊了一下，大方向不变的前提下，要专注在电信号检测上一段时间，荧光系统暂时搁浅，也验证小泉每问必出事，大家快恭喜他SCI收录吧。目前环境中唯一不变的就是时常在变化，人无近忧五味杂陈。

今天开始的系列是德国慕尼黑工大的一个组，一篇Analytical Chemistry，一篇JPhysics Condensed Matter，一篇Small和三篇Nano letter，特别是后三篇，相当滴有实力。去年开始看文献时就觉得名字眼熟，想来申请的时候有段时间很希望拿到TUM或者LMU的offer，误打误撞还发过骚扰邮件给他。当时我也没有申请现在的职位，也没了解过到底什么方向是前沿，他们组也没几篇文章上线，纯属误打误撞接触到。尽管当时网站上Rant哥照片有点彪悍，不是功成名就的大boss，但做的方向最接近，也就海投之了。事到如今，有生之年，居然狭路相逢，先发好人卡给他貌似很难了。

工艺部分很简单，关键步骤是ebeam litho加KOH etching，然后拍拍TEM，蒸镀金来缩孔。采用这样的方法主要还是湿法蚀刻精度的局限。PDMS coating之后在这种有机绝缘材料上沉积一个电极（如右上图所示），可以避免表面电荷的干扰。同比可以看出：氮化硅的纳米孔会比金纳米孔在低频有更低的噪声电流。金容易吸附DNA，所以表面修饰SAM。最后信号我没贴上来，因为真的没什么意思。

评：大牛测到一堆数据，沉淀啊低调啊，最后只把核心的拿出来发；小牛给大牛擦屁屁，测试结果实验细节讲的透彻；剩下的要无中生有妙笔生花。不是很清楚为什么要沉积金做界面，很奇怪。这个领域内很多新锐，有的攒rp一步升天，有的一步一个脚印，当然也能看到一些后继乏力越来越难发好文章的组，不胜唏嘘。看好Rant组的上升趋势，只不过对如何能利用好另辟的西经存在一些问号（后面详述）。

文献天天读 – 2011Apr19 – 0003

以前就在想：如果新的一周是从例会开始的，那么这个礼拜其余四天半都是放假该有多哈皮。现在如愿了这样的安排，不过一大早就要赶在会前准备两页ppt，实在也是身心俱疲。忙忙碌碌开会，取光学配件，做表征，装系统，还请教了一下comsol做仿真的meshing问题，似乎很充实。然而一个工作日的结束，随之而来的是落寞，有没有！哈哈，这个年纪不能用每天获得新知来麻痹自己了。

睡前速写一下这篇文章，我只看了感兴趣的部分，倒是对甲基化检测这方面有些想说的。甲基化是一个人们不为熟知的概念，不确定若干年后会不会炒作起来，大体上是氨基酸或核苷酸受到酶催化作用，H被CH3取代。用血型做例子不一定恰如其分，血型分A\B\AB\O就像碱基有A\T\G\C一样，近年来其他亚血型也慢慢被人了解。其实碱基也是一样，除了常规四种之外，也有mA、mC、hmC等等。以下一部分来自文献一部分来自wikipedia，个人总结如下：胚胎发育过程中表观遗传信息会被修饰增加至基因组，这一过程就有甲基化的参与，这样讲会不会明确很多呢。此外肿瘤也与甲基化水平相关，低甲基化水平可导致染色提不稳定、增加突变几率，可能是引发癌症的促进因素。某些基因的甲基化会是肿瘤形成的biomarker！因此如果我们的检测技术可以对甲基化进行快速廉价定位，相比市场需求不会比基因测序小。毕竟个人基因组测序一辈子一次差不多就够了，甲基化会不会成为年检标准，大家拭目以待吧。

目前薄层色谱、高效液相色谱、质谱都可以直接测甲基化，当然SMRT和纳米孔也可以测。各位有兴趣色谱质谱的小型化廉价化，也不妨了解一下后两者人们是如何检测的。SMRT的实验中发现甲基化的碱基在合成中比正常碱基的移位时间要长很多，这是和酶动力相关的一个过程，简单来说实验现象就是甲基化会一卡一卡的。也因此只要分析前后碱基之间的间距，就可以用主成分分析将甲基化的碱基区分出来。生物纳米孔可以检测到水解后单个核苷酸的不同电流信号，甲基化碱基的正态分布可以从正常碱基中区分出来，也很有前途。

胞嘧啶的甲基化检测最为热门。本文给出不同温度条件下DNA的过孔电流，简单来说就是我们可以在同一温度条件下区分出mC和hmC分布的不同，但是mC和C之前其实是重叠的，而随着高于10摄氏度后，hmC和mC引起电流变化的比值看起来是线性的。随后作者也给出了同样一段DNA上胞嘧啶甲基化百分比与电流变化之间的关系，可以线性规划，差别3%的学生氏检验置信值为91%。

评：其实我在这里评价本文是不够格的，因为后文都是在讲分子模拟来分析前面这些实验现象，小弟放弃了。现象既然存在，就必须要解释，至于理论的对错在目前来说不算很重要。这里发现热运动的规律很有意思，这意味着在碱基配对的过程中，一个小小甲基的位阻可能会改变双链的螺旋半径，通过物理的方法检测出来！当然这样的检测依赖于独立多次重复试验，当然置信度还有待提高，算是离商业化更进一步吧。趁着甲基化的热潮，固态纳米孔检测DNA片段甲基化的处女作就此诞生。

虽然网站主页上研究兴趣大多是物理相关的，总的来说Drndic姐接的导向看来是偏向于生物应用，针对几个热点不仅把握及时，实验方面也是一流，虽不及经典，也算是流行中一颗闪亮的星，被引用超过影响因子指日可待。物理背景的确在深入研究中优势显著，一转身发到JACS上了，工程背景就很容易陷入系统稳定性、可靠性的迷思。很难猜测下一篇会是怎样的内容，也证明招一个好的博后有多重要。

文献天天读 – 2011Apr18 – 0002

遇到同道中人很难，毕竟读博的方向很小，大家的交集只有那么一点点，可是我发现还是很多人愿意敞开心扉交流的。我始终抱持着今天讲的不会变成永恒的态度，有的时候一旦时间点过了就失去了效用。

还是继续昨天的专题吧，这篇文章是关于石墨烯的，相信zhaoying会很有兴趣。去年对于石墨烯是很重要的一年，我也是在诺奖提名后才意识到它的火红程度，一下子在自己的领域内出现了三篇有实验结果的文章，而且其中有两篇的题目都一模一样，几乎同时投稿和收录喔！当然文章发表后科技媒体的报道也出现作者混淆，实在是难免的乌龙，但凡一般人也不会去查证啦。科研不过就是自己爽爽，然后众人惊叹，路上还是认为博士是呆子，哈哈。

石墨烯上打纳米孔主要是它很薄很导电，薄的话就可以对碱基具有更好的分辨力，有可能测到单碱基（当然这只是号称，想测单碱基还是tunneling吧）。2009年起逐渐有理论科学家发表文章预测石墨稀形成的nanogap在1.4nm宽的情况下可以检测单碱基（且不论我觉得是否靠谱，至少是nano letter这种级别啊），几个月前韩国科学家在nature nanotechnology上又预测利用石墨烯的大pi键与碱基之间的强作用可以在电势上作出区分，可见接下来各组的竞争会有多激烈。不过如果石墨烯这么导电，那么应该是测不到离子电导变化的吧，不然就是石墨烯疏水，表面化学方面存在问题。

本文用从铜基底上转移来的3~15个单层，然后发现wetting有问题，就先5分钟UV ozone了。。。我看到这里开始费解，这么做不破坏了结构吗，表面会出现悬挂键或者氧键，亲水性会得到改进了，不过考虑到是石墨烯，应该不能这么来吧。接着他们又用ALD镀了一层TiO2，亲和性和亲水性都很好，不过这是把石墨烯当基底和牺牲层的做法吧。打孔的方式本身就在意单层与否，特别是厚度，细节上还需要zhaoying来讲一讲。

当然镀了这么一层TiO2跟通常的薄孔差异不大，可以做常规测试了。我们可以看到右边的两张彩色图，偏压分别是100mV和400mV，事件长度（一般更会用duration time，也就是持续时间）减小了，电流变化从0.2nA增大到1.5nA左右。电场强度增大时，会使得DNA过孔时受到更大的作用力，当然单位面积上阻碍的离子电流密度也会更大，所以过孔速度会更快。右下角的图统计了事件之间的等待时间，理论上这是一个等公交车的问题，是泊松分布。因此对时间数目取对数时这一段可以看作是线性关系，也成为capture rate，反映了体系中事件容易发生的程度。可以看出电场增强的时候事件更容易发生，考虑到电场力的作用在孔周围只有几十纳米甚至只有几纳米，不得不说这种作用是破坏DNA平稳运动的好方法。当然在电场没有作用的区域还是取决于扩散作用（热运动）啦。

评：ALD工艺很精准，但鉴于其contamination level高、耗时等问题，发发文章验证方法总还是ok的，很难批量生产，不过TEM打孔何尝不是呢。本文对问题的解决治标不治本，甚为可惜了，但是作为第一批吃螃蟹的，不失为一个不错的开始。后面没有什么特殊之处，不过工作确实钜细靡遗，可供该领域的人（不超过10个）做一些数据参考。

我对这片文章没有很爱，但是不代表他们做的不够出色。师兄说过，同样的工作人家发了nano letter，但是换成你就不一定可以。所以当真你就输了，大家都是混口饭吃，play and have fun！

文献天天读 – 2011Apr17 – 0001

承蒙古月同学的邀约，一起参与写科研博客。博客在推特围脖当道的今天已经是退流行了，而科研相关更不是大众流行的宠儿，IC界变数之快已然不是三年河东三年河西（遵循摩尔定律是一年半），读个博士转三个课题写thesis正合适不过。好在小弟虽地处强势IC研发中心，却打了个擦边球，从事纳米啊生物啊都有些相关交叉的课题。常常自爆背景是Biomedical Engineering的时候别人会一头雾水，也因此生物学忘记了我可以怪在编程太多损耗脑细胞，光学不懂是因为从事电路方面实验，只能悻悻然说自己是工程的底子。

废话一段之后开始正题，我在做的跟纳米孔和DNA相关，具体课题方向这里不方便公开，更重要的原因是因为自己刚入门，做着做着可能就歪掉了。纵观实验室前辈好像除了一个发过nature photonics的之外，大家都像非诚勿扰里选的心动女生一样，最后牵走的往往离初衷越来越远。所以目前从文献开始入手吧，手头上文献库里500+，看过了忘记的应该有一大半，尽量确保几天介绍一篇，如果有人感兴趣，或是正好阅读过，欢迎探讨和拍砖，拍在脸上也可以，就怕没有动静。

手头上刚看外几篇，顺便做了个slide。宾州这组是领域内的新贵，去年开始中文章，至今三篇，一片nature nanotechnology、一片nano letter、一片JACS，势头很猛，有没有！组里从Boston来了一个博后Wanunu，也就是本文的一作，那就让我们看看他们是有多“侥幸”！

标题是用薄纳米孔电信号快速检测特定探针的miDNA，内文分步介绍了薄纳米孔、miDNA的特异性纯化和检测。快速这个关键词有些微妙，电信号检测本身不是整个方法中的障碍，其他人的实验中也是同样的快，而miDNA杂交、磁珠纯化和脱附过程才是限制因素，这却又是成熟的技术，不是本文创新点。

如左三图所示，Free standing membrane是个很玄的东西，一般尺寸至少都有边长3微米的正方形，厚度在30纳米到60纳米。可能大家不是很有概念，如果面积太大，水或者酒精的表面张力就可以轻松毁掉这样的一层膜（可以想象几十纳米后的玻璃）。所以商用的dummy chip（其实我也很奇怪为什么这样的东西还有的卖，而且有销路！）也有是否stress free之分，虽然我不确定工艺参数，大抵上应该是退火的方法吧。于是这组人在氮化硅的薄膜上依然用电子束做pattern，Dry etch减薄。这一步大部分组都可以做，以往不只是减薄，而是直接打开的到纳米孔，我们组的伊朗人据说用这个技术得到纳米孔的可控直径最小是5纳米，当然这只是据说，因为他从此就不用这一技术了，可能是太超前没人跟他玩了吧。

减薄后的实验中，DNA过孔信号随着孔厚的减小而增大！从直方图统计中明显可以看到这一现象。从简单的电阻模型来看，电阻率由KCl的离子强度决定，这里基本不变，稳态电阻与孔径长度（即纳米孔厚度）成正比，与孔半径的平方成反比。当DNA穿过孔的时候，高盐度时DNA视为不良导体，在孔中占据了导电离子的空间。实验中用到的DNA长度一般远大于孔厚度，因此电阻变化与孔的厚度成正比，与DNA的轴向面积成反比。实验中开孔稳态电流和电流变化均随着孔厚的减小而增大。8nm厚可以将信号从200pA提升到4nA，非常的promising！

当然，由于孔很小很薄，更容易测短链的dsDNA，而且可以区分出DNA、RNA和tRNA信号的特征。此外给出的数据说明捕获速率与外加偏压成指数关系（他们加的电压300-600mV算是很高了，一般都是50-100mV），是DNA浓度的1.05次方。

miRNA一度火热，研究方法相对成熟，如右图所示：miRNA与探针杂交后可以通过修饰了p19蛋白的磁珠进行纯化。而洗脱的过程中可能会有来自蛋白（BSA）和表面活性剂（SDS）等等的干扰，通常前者会堵住纳米孔，后者似乎影响不大（有待考证）。文中对此作了对照组，当然拍拍脑袋想来总是有人去除过的，不是此文重点。

简评：纳米孔DNA检测的应用可以多样化，虽然大家终极目标是测碱基序，但这一过程中（也许是一二十年）便可以找到很多的医学应用，比如通过测量过孔时间取代现行的电泳技术，利用特异性识别检测疾病等等。本文更像是三个工作的合体，单发甚至不一定中small。这告诉我们，好人卡攒起来可以换nature，不过那也像他们一样工作扎实！